一、项目简介

本发明属于合成生物学与酶工程领域，具体涉及一种催化活性显著提高的对映-贝壳杉烯酸13-羟基化酶（KA13H）变体及其在微生物法中高效生产甜菊醇等氧化二萜类化合物的应用。

甜菊醇是生产天然甜味剂甜菊糖苷的关键前体，其传统生产依赖植物提取，存在步骤繁琐、效率低等问题。本发明通过对拟南芥或甜叶菊来源的KA13H进行理性设计，获得了具有更高羟基化活性的酶变体。核心改造策略包括：将酶蛋白N端的1-29位（或1-23位）氨基酸序列替换为特定的17α序列，并引入关键点突变（如I136A、I149L、I403L、V404L、L512I、L513I等），从而有效提升了酶与底物的结合亲和力及催化效率。

将该KA13H变体基因导入工程大肠杆菌，并重构从乙酰辅酶A到甜菊醇的完整生物合成途径，成功实现了甜菊醇的克级规模高产（摇瓶产量达521 mg/L，5升发酵罐产量达1.07 g/L）。该方法为甜菊醇及相关高价值二萜化合物的绿色生物制造提供了高效、可持续的解决方案。

二、专利摘要

本发明涉及对映‑贝壳杉烯酸13‑羟基化酶(KA13H)变体及其应用。具体提供一种羟基化活性提高的KA13H变体，其具有SEQ ID NO:1或2所示的序列并且N端1‑29位氨基酸进行替换。本发明揭示了重组型KA13H及其突变体，其用于生产甜菊醇可显著提升产量，同时减少中间体积累。

三、专利状态

本技术已递交中国专利申请，申请号：202210947431.3，实质审查中；持有人项目编号：SIPPE22-04。

四、持有单位

中国科学院分子植物科学卓越创新中心。

五、合作方式

转让、许可或合作研发。

六、联系方式

张雯，wzhang@cemps.ac.cn，021-54924138。