一、项目简介

本发明属于合成生物学与代谢工程领域，具体涉及一种在蓝细菌中构建CRISPR转录激活系统的方法，并应用该系统高效生产生物燃料异戊烯醇。

蓝细菌是能进行光合作用的微生物，能直接利用太阳能和二氧化碳合成化学品，是构建“光能自养细胞工厂”的理想底盘。然而，相较于大肠杆菌等传统模式微生物，蓝细菌的遗传操作工具相对匮乏且效率较低，限制了其开发应用。

本发明针对这一技术瓶颈，在模式蓝细菌聚球藻PCC 7942中，成功开发了一套高效的CRISPRa系统。该系统的核心在于：将失去DNA切割活性的dCas9蛋白与蓝细菌内源的RNA聚合酶ω-亚基进行融合表达，并利用强启动子表达向导RNA。当特定的sgRNA引导dCas9-RpoZ融合蛋白靶向目的基因的启动子区域时，能有效招募并稳定RNA聚合酶，从而显著激活基因转录。

通过敲除内源rpoZ基因、优化dCas9-RpoZ的表达以及筛选最佳sgRNA靶向位点，本发明对该系统进行了多轮优化，使其激活效率大幅提升。作为应用示范，本发明利用该CRISPRa系统对异戊烯醇的生物合成途径进行了工程改造。异戊烯醇是一种具有良好燃烧特性的重要生物燃料。通过同时激活异戊烯醇合成途径中的多个关键基因，并利用CRISPRi技术抑制竞争途径基因，成功将蓝细菌生产异戊烯醇的产量提高了17倍。这证明了该系统是构建光合自养细胞工厂的强大工具。

二、专利摘要

本发明提供了蓝细菌CRISPRa系统的构建方法及其在异戊烯醇生物合成中的应用。本发明公开了一种在蓝细菌中构建CRISPRa即转录激活系统的方法，以及应用带有该CRISPRa系统的蓝细菌进行生物合成的方法。所述方法基于蓝细菌中转录激活蛋白RpoZ，包括dCas9、RpoZ、目的基因与sgRNA。本发明的系统能够实现单基因的激活/高表达、多基因的同时激活/高表达，进一步设计调控元件还可实现其它基因的同时激活和抑制。

三、专利状态

本技术已递交中国专利申请，申请号：202310080830.9，实质审查中；持有人项目编号：SIPPE22-37。

四、持有单位

中国科学院分子植物科学卓越创新中心。

五、合作方式

转让、许可或合作研发。

六、联系方式

张雯，wzhang@cemps.ac.cn，021-54924138。