一、项目简介

本发明属于基因编辑技术与合成生物学领域，具体涉及一种高效、精准的HDR（同源定向修复）介导的基因编辑筛选系统。随着CRISPR等基因编辑工具的广泛应用，如何提高编辑效率（尤其是长片段精准插入）并实现高效富集阳性细胞已成为技术瓶颈。传统筛选方法依赖抗生素或荧光蛋白，但存在随机整合风险高、筛选标记残留、脱靶效应不可控等问题。

本系统的核心创新在于构建了一套多功能、高兼容性的筛选平台。该系统整合了以下关键元件：

• 双报告基因系统：通常包含两种不同的荧光蛋白编码基因（如增强型绿色荧光蛋白eGFP和红色荧光蛋白mRFP）和/或两种不同的药物抗性基因（如嘌呤霉素抗性基因PuroR和博莱霉素抗性基因ZeoR），这些基因通过可自我切割的短肽序列（如T2A、P2A）连接，确保多个蛋白可从一个转录本表达但独立行使功能。
• 精准的编辑效率提升策略：通过将筛选表达盒 flanked 在同源臂之间，并利用CRISPR系统在基因组特定位点产生双链断裂，该系统能通过HDR途径将外源片段精准插入目标基因座。研究表明，此类策略可实现高达82%的双等位编辑效率，显著优于传统方法。
• 高效的富集与清除机制：成功整合的细胞会同时表达两种报告基因，可通过流式细胞术或药物筛选进行高效富集。进一步的创新在于，通过在筛选盒两侧设计特异的酶切位点（如使用CRISPR系统），可利用单链退火修复等机制将筛选标记元件从基因组中精准切除，实现“无缝”编辑，避免外源序列残留，为后续研究或应用扫清障碍。

该系统为功能基因组学研究、疾病模型构建及基因治疗等领域提供了强大且可靠的工具。

二、专利摘要

本发明提供了一种基于HDR的筛选标签报告系统。本发明的筛选标签系统包含位于非功能选择基因直接重复序列内的CRISPR/Cas9单引导RNA(gRNA)靶位点。本发明中CRISPR/Cas9复合物会同时靶向基因组中待编辑的目的基因位点和筛选标签前体中的靶位点，将筛选标签前体修复成为完整筛选基因并产生筛选抗性。本发明的报告系统对DSB介导的生物编辑事件表现出更广泛的适应性和更高的筛选效率。

三、专利状态

本技术已递交中国专利申请，申请号：202410482471.4，实质审查中；持有人项目编号：SIPPE23-39。

四、持有单位

中国科学院分子植物科学卓越创新中心。

五、合作方式

转让、许可或合作研发。

六、联系方式

张雯，wzhang@cemps.ac.cn，021-54924138。